Tečne biopsije koriste krvno-tumorsko tkivo - da bi dijagnostikovale rak
Tipično, tumori se ispituju pomoću biopsija tkiva. Mali uzorak uzima se iz tumora i genotipizuje, ili se analizira za genetsku šminku. Problem sa ovim pristupom je da biopsijski tumori mogu biti izazovni. Štaviše, biopsija tumora daje samo sliku tumora.
Pisanje na Discovery Medicine u 2015, Labgaa i koautori navode sljedeće o konvencionalnoj tumorskoj biopsiji:
Iz očiglednih razloga, teško je pratiti evoluciju tumora putem sekvencijalnih biopsija. Takođe, biopsija ogleda samo jedno mesto tumora i stoga je malo verovatno da će predstavljati čitav spektar somatskih mutacija u velikim tumorima. Alternativa bi bila da se dobiju više biopsija za isti tumor, ali ova opcija ne izgleda ni realna niti tačna.
Tečna biopsija podrazumeva merenje cirkulišućeg DNK (ctDNA) i drugih nuspojava tumora u uzorcima krvi dobijenih od pacijenata sa kancem. Ovaj novi dijagnostički pristup obećava da je brz, neinvazivan i ekonomičan.
Istorija tečne biopsije
Godine 1948., Mandel i Metais, par francuskih istraživača je prvo identifikovao ctDNA u krvi zdravih ljudi. Ovo otkriće je bilo ispred svog vremena, i tek nekoliko desetljeća kasnije, ctDNA je dodatno istražena.
Godine 1977. Leon i kolege prvo su identifikovali povećanu količinu ctDNA u krvi kod pacijenata sa rakom.
Do 1989. godine Stroun i kolege identifikovali su neoplastične karakteristike (tj. Karcinom) u krvi. Nakon ovih otkrića, nekoliko drugih grupa identifikovalo je specifične mutacije supresora tumora i onkogena, mikrosatelitne nestabilnosti i DNK metilacije, što je dokazalo da ctDNA ulazi u cirkulaciju putem tumora.
Iako znamo da ctDNA iz tumorskih ćelija cirkuliše u krvi, poreklo, stopa oslobađanja i mehanizam oslobađanja ove DNK su nejasni, a istraživanje daje konfliktne rezultate. Neka istraživanja sugerišu da više malignih tumora sadrži više mrtvih ćelija raka i oslobađa više ctDNA. Međutim, neka istraživanja sugerišu da sve ćelije oslobađaju ctDNA. Ipak, izgleda da kancerozni tumori oslobađaju povećane nivoe ctDNA u krv, čineći ctDNA dobar biomarker kancera.
Zbog teške fragmentacije i niskih koncentracija u krvi, ctDNA je teško izolirati i analizirati. Postoji razlika u koncentraciji ctDNA između uzoraka seruma i plazme. Čini se da je krvni serum umjesto krvna plazma bolji izvor ctDNA. U studiji Umetanija i kolega utvrđeno je da su koncentracije ctDNA konzistentno niske u plazmi u poređenju sa serumom zbog mogućeg gubitka cirkulirajuće DNK tokom prečišćavanja, jer se koagulacija i ostali proteini eliminišu tokom pripreme uzorka.
Prema Heitzerovim i kolegama, evo nekih konkretnih pitanja koja treba rešiti da iskoriste dijagnostički potencijal ctDNA:
Prvo, preanalitičke procedure moraju biti standardizovane .... Izbor metode izolacije koji obezbeđuje ekstrakciju dovoljne količine visokokvalitetne DNK je kritičan i pokazalo se da preanalitički faktori uzimanja uzoraka krvi i obrade mogu snažno uticati na DNK prinos .... Drugo, jedno od najvažnijih pitanja je nedostatak harmonizacije metoda kvantifikacije. Različite metode kvantifikacije, ... proizvode različite rezultate zato što su ova mjerenja ciljna ili totalna ili samo pojačana DNK .... Treće, manje se zna o poreklu i detaljnom mehanizmu za otpuštanje ctDNA, au većini studija svodeći se na događaje koji takođe mogu doprinijeti otpuštanju ctDNA.
Ciljani nasuprot nenamjeranog pristupa
Trenutno, prilikom analize krvne plazme (ili seruma) za ctDNA postoje dva glavna pristupa. Prvi pristup je ciljan i traži specifične genetske promjene koje ukazuju na tumore. Drugi pristup je nepredviđen i uključuje analizu širokog genoma koja traži ctDNA refleksiju karcinoma. Alternativno, exome sekvenciranje se koristi kao pristup koji je ekonomičniji i neusaglašen. Exomi su delovi DNK koji se transkribiraju kako bi napravili proteine.
Sa ciljanim pristupima, serum se analizira za poznate genetske mutacije u malom skupu mutacija vozača.
Mutacije vozača odnose se na mutacije u genomu koji promovišu ili "daju" rast ćelija karcinoma. Ove mutacije uključuju KRAS ili EGFR .
Zbog tehnološkog napretka u posljednjih nekoliko godina, ciljani pristupi analizi genoma za male količine ctDNA postali su izvodljivi. Ove tehnologije uključuju ARMS (sistem ojačanja vatrostalnih mutacija); digitalni PCR (dPCR); perle, emulzije, amplifikacija i magnetika (BEAMing); i dubokom sekvencionisanju (CAPP-Seq).
Iako je došlo do napredovanja u tehnologiji koja omogućava ciljani pristup, ciljani pristup usmerava samo na nekoliko pozicija mutacija (hotspota) i nedostaje mnogo mutacija vozača, kao što su geni supresora tumora.
Glavna prednost nepredviđenih pristupa tečnoj biopsiji je u tome što se mogu koristiti kod svih pacijenata zbog činjenice da se test ne oslanja na ponavljajuće genetske promene. Reproduktivne genetske promjene ne pokrivaju sve vrste karcinoma i nisu specifični potpisi raka. Ipak, ovom pristupu nedostaje analitička osjetljivost i sveobuhvatna analiza tumorskih genoma još nije moguće.
Napominjemo da je cena sekvencioniranja čitavog genoma znatno opala. U 2006. godini cena sekvence ceo genoma iznosila je oko 300.000 dolara (USD). Do 2017. godine, cena je pala na otprilike $ 1,000 (USD) po genomu, uključujući reagense i amortizaciju mašina za sekvenciranje.
Klinička upotreba tečne biopsije
Prvobitni napori da se koristi ctDNA bili su dijagnostički i upoređivali nivoe kod zdravih pacijenata sa onima kod pacijenata sa kancerom ili onima sa benignim oboljenjem. Rezultati ovih napora bili su mešani, samo su neke studije pokazale značajne razlike koje ukazuju na stanje raka, stanja bez bolesti ili recidiva.
Razlog zbog kojih se ctDNA može koristiti samo neko vreme za dijagnozu raka jeste to što su promenljive količine ctDNA izvedene iz tumora. Nisu svi tumori "rasipali" DNK u istoj količini. Uopšte, napredniji, rasprostranjeni tumori bacili su više DNK u cirkulaciju nego ranije, lokalizovane, tumori. Pored toga, različiti tipovi tumora prelaze različite količine DNK u cirkulaciju. Frakcija cirkulirajuće DNK koja je izvedena iz tumora je široko promenljiva u svim studijama i tipovima karcinoma, u rasponu od 0,01% do 93%. Važno je napomenuti da se, uopšteno govoreći, samo mali broj ctDNA izvodi iz tumora, a ostatak od normalnih tkiva.
Cirkulirajuća DNK se može koristiti kao prognostički marker bolesti. Cirkulirajuća DNK se može koristiti za praćenje promena u raku tokom vremena. Na primjer, jedna studija pokazala je da dvogodišnja stopa preživljavanja kod pacijenata sa kolorektalnim karcinomom (tj. Broj pacijenata koji su živi najmanje dvije godine nakon dijagnoze raka debelog creva) i mutacije KRAS-a bile 100 posto u onima bez dokaza odgovarajuća cirkulirajuća DNK. Štaviše, moguće je da se u bliskoj budućnosti cirkulirajuća DNK može koristiti za praćenje prekanceroznih lezija.
Cirkulirajuća DNK se takođe može koristiti za nadgledanje odgovora na terapiju. Pošto cirkulirajuća DNK pruža bolju sveobuhvatnu sliku genetskog sastava tumora, ova DNK verovatno sadrži dijagnostičku DNK, koja se može koristiti umesto dijagnostičke DNK koja je postignuta od samih tumora.
Sada, pogledajte neke konkretne primjere tečne biopsije.
Guardant360
Guardant Health je razvio test koji koristi sekvenciranje sledeće generacije za profiliranje cirkulirajuće DNK za mutacije i hromozomske preuređenja za 73 gena koji se odnose na kancer. Guardant Health objavio je studiju o upotrebi tečne biopsije u onkologiji. Studija je koristila uzorke krvi od 15.000 pacijenata sa kombinovanim 50 tipova tumora.
U većini slučajeva rezultati testa tečnog biopsije poravnati sa izmenama gena posmatranih u biopsijama tumora.
Prema NIH:
Guardant360 je identifikovao iste kritične mutacije u važnim genomima vezanim za rak kao što su EGFR, BRAF, KRAS i PIK3CA na frekvencijama koje su vrlo slične onome što je prethodno bilo identifikovano u uzorcima biopsije tumora, statistički korelujući sa 94% na 99%.
Pored toga, prema NIH-u istraživači su naveli sledeće:
U drugoj komponenti studije, istraživači su procenili skoro 400 pacijenata - od kojih je većina imala pluća ili kolorektalni kancer - koji su imali i krv ctDNA i rezultate DNA tumorskog tkiva i upoređivali obrasce genomskih promjena. Ukupna tačnost biopsije tečnosti u poređenju sa rezultatima analize biopsije tumora iznosila je 87%. Tačnost se povećala na 98% kada su uzorci krvi i tumora prikupljeni u roku od 6 meseci jedni od drugih.
Guardant360 je bio tačan iako su nivoi cirkulirajuće DNK u krvi bili nizak. Često, cirkulirajuća tumorska DNK samo je činila 0.4% DNK u krvi.
Sve u svemu, koristeći tečnu biopsiju, istraživači Guardant bili su u mogućnosti da identifikuju tumorske markere koji bi direktno lečili lekari kod 67 posto pacijenata. Ovi pacijenti su bili podobni za tretmane odobrenih od strane FDA-a, kao i za terapije istrazivanja.
ctDNA i rak pluća
U 2016. godini, FDA je odobrila cobas EGFR Mutation Test koji će se koristiti za otkrivanje EGFR mutacija u cirkulirajućoj DNK pacijenata sa karcinomom pluća. Ovaj test je prva laboratorijska biopsija koju je odobrila FDA i identifikovani pacijenti koji mogu biti kandidati za liječenje ciljanim terapijama koristeći erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) i gefitinib (Iressa) kao prvu liniju liječenja, a osimeritinib (Tagrisso) kao liječenje drugog reda. Ove ciljane terapije napadaju ćelije raka sa specifičnim EGFR mutacijama.
Važno je, zbog velikog broja lažno negativnih rezultata, FDA preporučuje da uzorak biopsije tkiva uzima i pacijent koji ima negativnu biopsiju tečnosti.
ctDNA i rak jetre
Broj ljudi koji umiru od karcinoma jetre porastao je u poslednjih 20 godina. Trenutno je rak jetre drugi vodeći uzrok smrti od raka u svijetu. Nema raspoloživih biomarkera za otkrivanje i analizu jetre ili hepatocelularnog (HCC) karcinoma. Cirkulirajuća DNK može biti dobar biomarker za rak jetre.
Razmotrimo citat iz Lagbae i koautora o potencijalu upotrebe cirkulirajuće DNK za dijagnozu raka jetre:
Hipermetilacija RASSF1A, p15 i p16 su predložena kao rana dijagnostička sredstva u retrospektivnoj studiji, uključujući 50 HCC pacijenata. Potpisan je i četiri nepotrebna metilovana gena (APC, GSTP1, RASSF1A i SFRP1), dok je metilacija RASSF1A prijavljena kao prognostički biomarker. Kasnije studije analizirale su ctDNA kod pacijenata sa HCC-om koristeći tehnologije dubokog sekvenciranja .... Izuzetno, numerički kopirani brojevi DNK su detektovani u dva HBV nosača bez prethodne istorije HCC-a u vreme sakupljanja krvi, ali koji su razvili HCC tokom praćenja. Ovaj nalaz otvorio je vrata za procjenu varijacije broja kopija u ctDNA kao alatu za pregled ranog otkrivanja HCC-a.
Reč od
Tečne biopsije su uzbudljiv novi pristup genomskoj dijagnozi. Trenutno, određene tečne biopsije, koje pružaju sveobuhvatno molekularno profilisanje, dostupne su lekarima kako bi dopunili genetske informacije dobijene od biopsije tkiva. Postoje i određene tečne biopsije koje se mogu koristiti umesto tkivne biopsije - kada biopsije tkiva nisu dostupne.
Važno je imati na umu da su u toku mnoga ispitivanja o biopsiji u tečnom stanju i da se radi na istraživanju radi izbjegavanja terapijske upotrebe ove intervencije.
> Izvori:
> Test krvi za genetske promjene u tumorima pokazuje obećanje kao alternativu biopsiji tumora. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Cirkulirajuća tumorska tumora kao tečna biopsija za rak. Klinička hemija. 2015; 61: 112-123. doi: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Tečna biopsija kod karcinoma jetre. Discovery Medicine. 2015; 19 (105): 263-73.
> Tečna biopsija: Korišćenje DNK u krvi za otkrivanje, praćenje i liječenje raka. NIH.
> Umetani N, i sar. Veća količina slobodne cirkulacije DNK u serumu nego u plazmi nije uglavnom izazvana kontaminiranom vanzemaljskom DNK tokom razdvajanja. Ann NY Pronađeno 1 knjiga, stranica 1 od 1 Acad Sci. 2006; 1075: 299-307.
> Wellstein A. Opšti principi u farmakoterapiji raka. U: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: Farmakološka osnova terapeutike, 13e New York, NY: McGraw-Hill.